Разработан метод детекции вирусной РНК, основанный на ДНК-нанопереключателях, который специфично определяет РНК вируса SARS-CoV-2.
YuryLukin
1196 view(s)
Ученые из США разработали платформу для детекции РНК-вирусов в образцах с использованием ДНК-нанопереключателей (DNA nanoswitches). В статье, опубликованной в Science Advances, они описывают процесс адаптации платформы к клиническому применению.
ДНК-нанопереключатель — это ДНК-структура, которая меняет конформацию при контакте с таргетной нуклеотидной последовательностью. В «выключенном» состоянии нанопереключатель представляет собой линейный дуплекс, состоящий из одноцепочечной матрицы (последовательность фага M13) и набора комплементарных ей олигонуклеотидов. При этом два олигонуклеотида (детекторы) содержат участок, комплементарный таргетной последовательности. При связывании мишени с детекторами на нанопереключателе образуется петля, он переходит во «включенное» состояние. Присутствие мишени в образце определяется с помощью гель-электрофореза: «выключенный» и «включенный» нанопереключатели мигрируют в геле с разной скоростью.
Ученые подтвердили возможность детекции РНК-вирусов с помощью ДНК-нанопереключателей на вирусе Зика. Для экспериментов они использовали плазмиду pFLZIKV, содержащую полную последовательность генома вируса. РНК с плазмиды транскрибировалась in vitro.
Так как длинная РНК вируса может образовывать вторичные структуры, снижающие вероятность ее связывания с нанопереключателем, авторы расщепили ее на фрагменты короче 200 нуклеотидов. Детекция фрагментированной РНК вируса Зика с помощью одного нанопереключателя прошла успешно. Ученые повысили чувствительность платформы, сконструировав множество нанопереключателей, каждый из которых распознавал свой участок вирусного генома. При использовании комбинации из 18 ДНК-переключателей система детектировала РНК вируса Зика в концентрации 2,1×106 копий в 10 мкл реакционной смеси.
Специфичность платформы подтвердили на геномах вирусов Зика и Денге. Было показано, что нанопереключатели, распознающие вирус Зика, не реагируют на вирус Денге, и наоборот. Авторы сконструировали нанопереключатели для детекции вирусов Зика и Денге таким образом, что при связывании с мишенями они мигрировали в геле с разной скоростью. Это дало возможность одновременно выявлять присутствие РНК двух возбудителей в смеси.
Ученые также показали, что с помощью ДНК-нанопереключателей и стратегии NASBA можно детектировать РНК SARS-CoV-2. Метод позволял обнаружить транскрибированную in vitro РНК нового коронавируса в человеческой слюне в минимальной концентрации 200 копий/мл.
Авторы отмечают, что анализ с помощью ДНК-нанопереключателей не требует сложной лабораторной инфраструктуры, а потому имеет относительно низкую стоимость. Они утверждают, что процесс конструирования и очистки нанопереключателей быстрый и несложный: платформу можно адаптировать к новому вирусному патогену в течение одного-двух дней с момента получения последовательности-мишени, что позволит снизить экономический и демографический ущерб от эпидемии.
Ученые из США разработали платформу для детекции РНК-вирусов в образцах с использованием ДНК-нанопереключателей (DNA nanoswitches). В статье, опубликованной в Science Advances, они описывают процесс адаптации платформы к клиническому применению.
ДНК-нанопереключатель — это ДНК-структура, которая меняет конформацию при контакте с таргетной нуклеотидной последовательностью. В «выключенном» состоянии нанопереключатель представляет собой линейный дуплекс, состоящий из одноцепочечной матрицы (последовательность фага M13) и набора комплементарных ей олигонуклеотидов. При этом два олигонуклеотида (детекторы) содержат участок, комплементарный таргетной последовательности. При связывании мишени с детекторами на нанопереключателе образуется петля, он переходит во «включенное» состояние. Присутствие мишени в образце определяется с помощью гель-электрофореза: «выключенный» и «включенный» нанопереключатели мигрируют в геле с разной скоростью.
Ученые подтвердили возможность детекции РНК-вирусов с помощью ДНК-нанопереключателей на вирусе Зика. Для экспериментов они использовали плазмиду pFLZIKV, содержащую полную последовательность генома вируса. РНК с плазмиды транскрибировалась in vitro.
Так как длинная РНК вируса может образовывать вторичные структуры, снижающие вероятность ее связывания с нанопереключателем, авторы расщепили ее на фрагменты короче 200 нуклеотидов. Детекция фрагментированной РНК вируса Зика с помощью одного нанопереключателя прошла успешно. Ученые повысили чувствительность платформы, сконструировав множество нанопереключателей, каждый из которых распознавал свой участок вирусного генома. При использовании комбинации из 18 ДНК-переключателей система детектировала РНК вируса Зика в концентрации 2,1×106 копий в 10 мкл реакционной смеси.
Специфичность платформы подтвердили на геномах вирусов Зика и Денге. Было показано, что нанопереключатели, распознающие вирус Зика, не реагируют на вирус Денге, и наоборот. Авторы сконструировали нанопереключатели для детекции вирусов Зика и Денге таким образом, что при связывании с мишенями они мигрировали в геле с разной скоростью. Это дало возможность одновременно выявлять присутствие РНК двух возбудителей в смеси.
Ученые также показали, что с помощью ДНК-нанопереключателей и стратегии NASBA можно детектировать РНК SARS-CoV-2. Метод позволял обнаружить транскрибированную in vitro РНК нового коронавируса в человеческой слюне в минимальной концентрации 200 копий/мл.
Авторы отмечают, что анализ с помощью ДНК-нанопереключателей не требует сложной лабораторной инфраструктуры, а потому имеет относительно низкую стоимость. Они утверждают, что процесс конструирования и очистки нанопереключателей быстрый и несложный: платформу можно адаптировать к новому вирусному патогену в течение одного-двух дней с момента получения последовательности-мишени, что позволит снизить экономический и демографический ущерб от эпидемии.
Город: